水中细菌总数和大肠菌群的检测|水源水中大肠菌群检测
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摘 要：各种天然水中常含有一定数量的微生物，水中微生物的含量及种类决定了水质的优劣。本实验了解和学习了水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。通过稀释平板计数法和多管发酵法分别检测了水中细菌总数和水中大肠菌群总数。实验结果具有一定误差，但基本完整，具有较好的科学性。
关键词：水中细菌总数；大肠菌群；稀释平板计数法；多管发酵法
各种天然水中常含有一定数量的微生物，如水生性微生物(如光合藻类)、土壤及空气微生物、动物尸体及分泌物微生物、生活污水中微生物等。水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)]，可用稀释平板计数法检测。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。 1
材料、仪器与试剂 1.1
材料
直饮水（取自理工楼）、自来水（取自实验室）、河水（取自紫竹院） 1.2
仪器
高压灭菌锅、无菌培养皿、德汉氏小管、温箱、移液器、无菌操作台、酒精灯、接种环、锥形瓶、试管等
1.3
试剂
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂等 2
实验方法 2.1
培养基的配置
1水中细菌总数测定——牛肉膏蛋白胨琼脂培养基： ○
牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5.0 g，琼脂8g，蒸馏水1000ml； pH 7.0。
2水样初发酵——乳糖胆盐蛋白胨培养基： ○
1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL、水1000mL、pH 7.2－7.4，分装9ml/管,装上德汉氏小管并排气； 3×：除水以外，其余成分取三倍用量；
分装5ml/管或50ml/瓶，装上德汉氏小管并排气。灭菌条件：115℃，15min。
3EMB培养基： ○
用于大肠菌群菌落鉴定，脱水培养基，按说明书操作，补加琼脂粉4g/L。
2.2
水样的取用
1自来水和直饮水 ○
先将自来水和直饮水水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，用灭菌三角瓶接取水样以备分析。
2河水 ○
在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存，6h以内使用。
2.3
稀释平板法测定水中细菌总数
1按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释，保证30~300菌落/平皿。直饮水稀释100；自来水○
稀释100 、10-1 ；河水稀释10-110-210-3。
、
、
2选择以上稀释度，吸取1 mL于无菌培养皿，加入冷却至 45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约○
15ml，立即混匀，静置使培养基凝固。每个稀释度作2个重复。
3.将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即○
得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2.4
多管发酵法测定水中大肠菌群
1自来水 ○
1）初发酵实验
100mL水样两份：无菌操作法加入两个装有已灭菌的50mL 的3×浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液烧瓶中（内有倒置小管），充分混匀；
10mL水样10份：无菌操作法加入各装有5mL的3×乳糖胆盐蛋白胨的发酵试以上材料置于37℃恒温箱内培养24h。
2）平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸产气的发酵管用接种环挑取一环发酵液于伊红美蓝培养基上划线，置于37℃培养箱内培养24h。
3）阳性菌落革兰氏染色：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落：粉红色，中心色较深的菌落，各挑一种染色。
4）查表计算
根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。
2河水 ○
将水样做1:10倍稀释，取适当的三个连续梯度，每梯度3份。本实验选取的稀释梯度：1、 10-1、10-2，均用1mL。用1×乳糖胆盐蛋白胨培养液。置于37℃恒温箱内培养24h。上述各发酵管经培养24h后，将产酸产气的发酵管用接种环挑取一环发酵液于伊红美蓝培养基上划线，置于37℃培养箱内培养24h。观察菌落特征。 3
实验结果 3.1
水中细菌总数测定结果
图1 水中细菌总数稀释平板结果
如上图所示，水中细菌总数测定的6个平板均无出现菌落。试推测原因可能有两点：一是倒平板时培养基温度过高，稀释平板计数法采用的是混菌培养的方法，倒平板时培养基温度不宜高于45℃，可能由于操作不当及温度不好准确把握致使培养基温度过高而烫死细菌，因而未出现菌落；二是水样稀释倍数过高，直饮水和自来水可能因为本身含有细菌数极少，稀释后更是少有，故而未出现菌落，而河水水样则由于1000倍的稀释倍数过高，使得稀释后水中细菌数很少，因而未出现菌落。
3.2 水中大肠菌群数测定结果
图2 自来水水样初发酵结果
图3 河水水样初发酵结果
如图2所示，自来水水样初发酵后有明显的菌落存在，但并没有产酸产气现象，因而可确定自来水中含有一定量的细菌但是大肠菌群含量十分少，合乎水质标准。
如图3所示，左起前三管为未稀释的河水，中间三管是稀释10倍的河水，最后三管是稀释100倍的河水，每管体积=9ml（1×浓缩液）＋1ml（河水）。前六管有明显的产酸产气现象，说明河水中有大肠菌群，后三管可能由于浓度太低，未出现产酸产气现象。根据初发酵结果，对河水中产酸产气的6管水样进行分离培养，所得结果如下。
1○2○3 ○
4○5○6 ○
7○8 ○
图4 EMB涂布平板分离结果图
（图中1-3号平板为未稀释水样涂布结果，4-6号平板为稀释10倍水样涂布结果；7号平板为白葡
萄球菌涂布标准图，8号平板为大肠杆菌涂布标准图）
如图4所示，EMB培养基为选择分离培养基，大肠菌群可顺利生长，其他则被抑制不能生长。未稀释水样涂布结果显示菌落呈紫红色，稀释10倍水样涂布结果显示菌落呈粉红色，且有一管水样未生长出菌落。
表1 水中大肠菌群测定结果
根据上表所示结果，经查阅水中大肠菌群MPN表，可得：MPN=140，即，每100ml水样中约含有140个大肠菌群细菌。 4
结果讨论
本次实验中，由于实验人员的操作失误，导致细菌总数测定实验失败，未能得到结果。经过进一步分析得知导致失败的原因可能有两个，一是倒平板时培养基温度过高，二是水样稀释倍数过大。具体情况在实验结果一中已做出分析。
本次试验中，多管发酵法测水中大肠菌群数的是实验总体来说较为成功。自来水中大肠菌群的含量合乎《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)标准，每1L水中不超过3个。而河水中每100ml含有约140个大肠菌群细菌，即每升水中含有约1400个大肠菌群细菌。经
查阅《中华人民共和国地表水环境质量标准》(GB3838-2002)，粪大肠菌群≤2000个/L即为Ⅱ类水质：主要适用于集中式生活饮用水地表水源地一级保护区、珍稀水生生物栖息地、鱼虾类产卵场、仔稚幼鱼的索饵场等。由此可知，紫竹院河水的水质仍较好，污染较少。
参考文献：
[1] 蔡信之,黄君红.微生物学(第三版)[M].北京:科学出版社,2011. [2] 沈萍,陈向东.微生物学实验(第四版)[M].北京:高等教育出版社,2007. [3] GB/T 3838-2002.地表水环境质量标准[S].北京:中国环境科学出版社,2002. [4] GB/T5749-2006.生活饮用水卫生标准[S].北京:中国环境科学出版社,2006.
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