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    【MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结】 小鼠胚胎成纤维细胞3T3

    时间:2019-07-11 08:31:15来源:佩佩美文网 本文已影响 佩佩美文网手机站
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    MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

    2008-06-19 00:00 来源:丁香园 点击次数:

    知识总结

    分享到: 收藏夹 腾讯微博 新浪微博 开心网 1517 关键词: MEF小鼠 胚胎成纤维细胞

    小鼠胚胎成纤维细胞的富集

    1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后,实施断颈法处死小鼠。

    2、用70%乙醇擦拭腹部,把皮肤向后拉,暴露出腹膜。用消毒过的工具,剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

    3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

    4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开,分离后切除内脏(所有深色的东西)。将胚胎转移到(有盖)培养皿中,用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

    5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎,当你剪的很累以致于不能再剪的时候,加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA,并在37℃孵育大约20分钟。此时,返回至第一步,对下一只鼠进行操作。

    6、执行1-4步,到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

    7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎,直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

    8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化,将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

    9、混匀管内的物质,加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

    10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

    11、将胚胎置于PBS中,并重复第5步。

    12、第二天更换培养基,以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

    13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时,是冻存细胞的最佳时期。一般说来,这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生,所以请注意观察你的培养瓶。

    注释:

    我们已用CF-1品系的鼠制备了成纤维细胞。

    培养基成分:

    88% DMEM

    10% FBS

    1% NEAA

    1% 双抗

    对于新建立的细胞系,要对样本进行支原体检测。

    小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

    1、移去MEF培养基

    2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞(以去除胰蛋白酶的抑制物)。

    3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA(0.05%的胰蛋白酶),消化5min。

    4、为了使细胞分散开,轻轻吹打细胞。

    5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA,加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

    6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中,吹打几次,使细胞分散为单个的。

    7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

    8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中,放在37℃培养箱中进行培养。

    注释:

    MEF培养基成分:

    89% DMEM (Gibco # 12100-046)

    10% FBS (Gibco # 16000-044)

    1% NEAA (Gibco # 11140-050)

    MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5,但是最后一次的传代(第4代或第5代)比例应该是1:2。

    小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

    重悬培养基:

    80% DMEM

    20% FBS

    1% NEAA

    冻存培养基:

    60% DMEM

    30% FBS

    20% DMSO

    1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

    2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

    3、将细胞吹打下来。

    4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。

    5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在,可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。

    6、取上清液,将其分装到锥形管中,1000rpm离心5min。

    7、每个冻存瓶中加入0.5ml(冻存液的一半体积)的重悬培养基重悬细胞。

    8、逐滴加入等体积的(0.5ml/瓶)冻存培养基,混匀。现在DMSO的浓度是10%。

    9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。

    10、迅速将细胞转移到冻存的容器中,-70℃冻存过夜。(细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下)

    11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。

    注释:

    提前标注好冻存细胞的以下信息

    细胞系名称

    传代的代数

    冻存细胞的数目

    日期

    Initials

    注明冻存/解冻形式

    小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏

    1、将冻存瓶从液氮中取出。

    2、放在37℃水浴中快速解冻,being careful not to immerse the vial above the level of the cap.

    3、当仅还有一点冰晶残留时,用95%的乙醇消毒冻存瓶的外面,并将其置于hood中。(为什么用95%的乙醇消毒?hood是什么?)

    4、轻轻地上下翻转细胞一次,将它们放入15ml锥形管中。

    5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击,你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。

    6、1000rpm离心5min。

    7、将细胞重悬于10ml培养基中,然后放入T75培养瓶中。

    8、放入37℃培养箱。

    9、注明冻存/解冻的形式,以更新数据。

    1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠?希望大家能够介绍一下自己所采用的方法,集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠,到成熟(8~10 w)后,分三周合笼,(每周合笼一对),然后待最早合笼的小鼠产崽后,再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行,也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。

    2、关于提取MEF的比较好的protocol

    3、关于MEF转染时起耐受性如何?这个我以后主要做这些,可能会积累一定的经验,但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作,希望能够分享经验。

    4、关于其分泌细胞因子能力?我从一些文献上发现,MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外,也是研究天然免疫的重要材料,如日本东京大学的AKIRA的实验室,大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出,MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞,相当于肝实质细胞,略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞,我认为有其不可替代的优势:

    (1)其并不是主要发挥免疫功能的细胞,只有在受到外界刺激时才会应答,分泌细胞因子,免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子,即使有严格的control 组,但专门的免疫细胞即使是同一种细胞(DC,NK,T)但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。

    (2)另一方面,由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的,不太容易转染,结果阳性率也会较低。

    (3)现在的分离MEF的方法很便宜,不复杂,而分离纯的免疫细胞(如NK,DC),需要MACS,FACS等,这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说,不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞,如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因,或者蛋白,或者某一信号通路等的作用,MEF 细胞不失为一种选择。

    网友crepi 的观点:

    1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点

    2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了,表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了

    3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱

    4、原代培养的最大天敌还是污染

    网友baichangming的观点:

    MEF对培养基和血清的要求不高,一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12,生长情况都行,而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错,因为要养干细胞,所以现在换成进口Gibco胎牛的血清(两千多/500ml),感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是1

    6.66666%。

    网友北羽迦楼的观点:

    细胞没别的,就是很容易老化,一般我都是1:5~1:3传代,3代之后细胞就出现衰老了,我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓,细胞立体效果不错,在相差显微镜下,细胞核清晰,细胞纤长,正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足,但是同样有着更加明亮的轮廓,与细胞边缘相比,细胞呈深色(我觉得是透光效果不好)。一般在4×下观察最能看出细胞的状态,此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害,细胞的透光效果增加,说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话,出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

    我们用的就是WiCell的protocal养,和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min,用什么酶不重要,我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要,传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得,0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO),5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞(神经、上皮)就没那么快了。

    附带一句,易消化易贴壁是fibroblast的共性。

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