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    蛋白的纯化 包涵体蛋白的纯化和复性

    时间:2019-09-16 08:24:09来源:佩佩美文网 本文已影响 佩佩美文网手机站
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    1.菌体的收集和破碎

    用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物,8000 rpm 4℃离心10min。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

    【备注】超声破菌缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶)

    重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎,其条件为:功率为300W,占空比50%,每个循环30 s,总时间20 min。破碎后的匀浆,4℃、 12000 rpm离心15 min。分别取上清液和沉淀进行12%SDS-PAGE分析,确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

    2.包涵体的处理

    洗涤:沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后,搅拌洗涤20~30min,于4℃,12000 rpm离心15 min,弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L TrispH8.0溶液洗涤一遍(以去除残留的EDTA),于4℃ 12000 rpm离心15 min,弃去上清液。

    【备注】包涵体洗涤缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,0.5mol/L NaCl,2 mol/L尿素,2% Triton)

    2%Triton X-100溶液:量取2mlTritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液,加M缓冲液98ml即可。

    溶解:沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬,室温搅拌5-6小时或过夜。12000 rpm4℃离心15 min,收集上清液。

    【备注】包涵体溶解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.5 mol/L NaCl,8 mol/L尿素,0.2 mmol/L DTT或100 mmol/Lβ-巯基乙醇,2%Triton)

    3.目的蛋白的纯化

    亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留,其他杂蛋白会流过柱子。

    谷胱甘肽S-转移酶(GST)是最常用的亲和层析纯化标签之一,带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化,但本方法有以下缺点:首先,蛋白上的GST必须能合适的折叠,形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化;其次,GST标签多达220个氨基酸,如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性,使形成包涵体,这会破坏蛋白的天然结构,难于进行结构分析,有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

    另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子,在中性或弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合,在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点:首先,由于只有6个组氨酸,分子量很小,一般不需要用酶切去除;其次,可以在变性条件下纯化蛋白,在高浓度的尿素和胍中仍能够保持结合力;另外6组氨酸标签无免疫原性,重组蛋白可直接用来注射动物,也不影响免疫学分析。虽然有这么多的优点,但此标签仍有不足,如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液,不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链,而且柱子也会非特异吸附蛋白质,影响纯化效果。若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合,或者需要某种特殊的辅因子,可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱,结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。

    融合蛋白的表达和纯化过程:

    1.挑单菌落于3-5 ml 2YT或LB 培养中,37℃过夜培养。

    2.按1:100的比例取过夜培养液转接。37℃扩大培养至OD 0.5左右。

    3.加入IPTG终浓度0.2~0.4 mM/L。 37℃摇床培养4~6h。

    4.12000g离心15min,去上清。按40ml/100ml菌液加入1×Binding Buffer {破碎缓冲液组成:50mM Tris pH7.0~8.5左右,1mM EDTA,溶菌酶(10 礸/g cell),;或 20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA,0.1mM PMSF, DNAse (10 礸/g cell)}细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂,故不溶解包涵体。或4×PBS重悬细胞。

    5.超声波破碎:占空比50%,超声15s,停15s,10~20min。破碎后的匀浆在4℃,12,000rpm下离心30 min,弃去上清液。

    6.洗涤包涵体:2M尿素在50mM Tris pH7.0~8.5左右,1mM EDTA,10% Triton X-100中洗涤。洗涤2~4h去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA,10% TritonX-100,二硫键还原剂中洗涤。洗涤4~8h,使包涵体变性可溶。

    7. 过Ni柱:

    Ni2+亲和层析柱纯化

    包涵体溶解后的上清液,用镍亲和层析柱纯化。操作过程参照Amersham PharmaciaBiotech公司提供的操作指南进行。具体过程如下:转移树脂到柱子,待完全沉淀后,用三蒸水洗涤镍亲和层析柱,以除尽基质中的乙醇和空气,并防止下一步Ni2+沉淀;5×柱体积的ChargeBuffer充电;20×柱体积的三蒸水洗涤,去尽游离的Ni2+;10×柱体积的BindingBuffer平衡柱子;手工上样,根据蛋白的浓度来确定上样体积;20×柱体积的BindingBuffer洗涤,至检出无蛋白,并收集流出液,用于12%SDS-PAGE电泳检测;6×柱体积的WashBuffer洗涤,至检出无蛋白;Elution Buffer洗脱,每次1mL,收集洗脱流出液,洗脱至检出无蛋白;10×柱体积的BindingBuffer平衡。此时,即可用于纯化同种蛋白,不需重新充电。

    纯化操作完成后,加5×柱体积的StripBuffer洗涤,去尽Ni2+;10×柱体积的三蒸水洗涤去尽EDTA;加5×柱体积的0.5mol/L NaOH,静置0.5-2h,去沉淀的蛋白质;三蒸水洗涤,至流出液的pH值为7.0;20%乙醇洗涤,再加适量20%乙醇,于4℃保存。

    A、过柱前的注意事项:

    a、样品必须澄清、无颗粒物,否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命;

    b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME;

    c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl,以防止杂离子与Ni离子竞争;

    B、过Ni柱的操作步骤:

    ①用DDW洗涤,洗去20%的乙醇、除尽基质中的空气,并能防止下一步中Ni离子沉淀;

    ②⑩5×柱体积的Charge Buffer(50mM NiSO4)充电;

    ③5×柱体积的DDW洗涤,去游离的Ni离子;

    ④10×柱体积的Binding Buffer(20mM Tris-HCl,0.5MNaCl,5mM咪唑,pH8.0)平衡;

    ⑤上样(手工上样,样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定);

    ⑥10×柱体积的Binding Buffer洗涤,至无蛋白检出,用三氯醋酸检测,收集流出液;

    ⑦Elution Buffer(20mM Tris-HCl,0.5MNaCl,500-1000mM咪唑,pH8.0)洗脱,每次1ml,应呈现正态分布(两边稀,中间浓);

    ⑧10×柱体积的BindingBuffer洗涤。此时,即可用于纯化同种蛋白,很少需要重新充电。

    ⑨用20%的乙醇充满柱子,保存在4℃。

    注:同种蛋白纯化5~10次后,应进行strip和re-charge。

    C、柱的清洗与保存(最好每天清洗一次):

    (1)去Ni离子:

    ①5×柱体积的Strip Buffer(20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mMEDTA,pH7.4)洗涤;

    ②10×柱体积的DDW洗涤。

    (2)去沉淀的蛋白质:

    ①5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子,静置0.5~2hr;

    ②DDW洗涤,至流出液的pH值为7。

    (3)保存:20%乙醇洗涤,再加20%乙醇保存于4℃。

    D、柱的再生:

    当流速很慢、充电后基质不变成蓝绿色时,应进行柱的再生。

    ①2×柱体积的6M盐酸胍洗涤,然后3×柱体积的DDW洗涤;

    ②1×柱体积的2%SDS洗涤;

    ③5×柱体积的0.5MNaOH装满柱子,静置0.5~2hr;

    ④5×柱体积的DDW洗涤,然后5×柱体积的100mMEDTA,pH8.0洗涤;

    ⑤3×柱体积的DDW洗涤,然后3×柱体积的20%乙醇洗涤;

    ⑥20%乙醇保存于4℃。

    【备注】Ni2+亲和层析柱纯化缓冲液(1×Buffer):

    ?/P>

    reagents

    Binding Buffer

    Wash Buffer

    Elute Buffer

    Strip Buffer

    Charge Buffer

    M

    Tris-HCl pH7.9

    20 mM

    20 mM

    20 mM

    20 mM

    121.14

    Imidazole

    5 mM

    60 mM

    1M

    60.08

    NaCl

    0.5 M

    0.5 M

    0.5 M

    0.5 M

    58.44

    EDTA

    100 mM

    372.24

    NiSO4

    50 mM

    262.85

    4. 目的蛋白的SDS-PAGE

    分别取加有IPTG的空载体pET22(b+)表达的上清液、未加IPTG和加IPTG诱导的重组子全提取物、超声波破碎后的上清液和沉淀(即包涵体)、纯化后的蛋白溶液,进行12%SDS-PAGE分析。通过蛋白质分子量标准,判断目的蛋白的相对分子质量,并对纯化后的蛋白进行纯度分析。

    5、蛋白质的复性

    目的蛋白在大肠杆菌中以包含体形式存在,要获得有活性的产物,必须对纯化的目的蛋白进行复性。将收集的洗脱流出液装入透析袋,对含适量甘油的0.01mol/L PBS pH8.0透析48 h,每4~8h更换一次PBS溶液。然后,将上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中,对蛋白溶液进行浓缩。

    【备注】PBS配方:

    配制 0.01 M PH 7.4PBS 2L:

    0.2 mol/LNa2HPO4(mL)81.0

    0.2 mol/LNaH2PO4(mL)19.0

    NaCL17 g

    用水稀释到2 L即可。

    另外,可加入下列重折叠(复性)介质:

    ①氧化还原系统:还原/氧化型谷胱甘肽(10:1~3:1)

    ②L-Arg或Gly(0.5mol/L)

    ③甘油:10%

    ④聚乙二醇(浓缩)

    ⑤高摩尔浓度的Tris(0.4~1mol/L)

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